PCR, реаксияи занҷири полимеразӣ мебошад, ки ба илова кардани dNTP, Mg2+, омилҳои дарозшавӣ ва омилҳои тақвияти амплификация ба система таҳти катализи полимеразаи ДНК бо истифода аз ДНК-и волидайн ҳамчун қолаб ва праймерҳои мушаххас ҳамчун нуқтаи ибтидоии васеъшавӣ дахл дорад. Тавассути қадамҳои денатуратсия, тозакунӣ, васеъшавӣ ва ғайра, раванди репликатсияи риштаи ДНК-и духтар дар in vitro, ки ба ДНК-и риштаи волидайн мукаммал аст, метавонад ҳама гуна ДНК-и мақсаднокро дар in vitro зуд ва махсус тақвият бахшад.
1. Hot Start PCR
Вақти оғози пурзӯркунӣ дар ПЗР муқаррарӣ барои гузоштани мошини ПЗР ба мошини ПТР нест ва он гоҳ барнома ба пурзӯршавӣ оғоз мекунад.Вақте ки конфигуратсияи система ба итмом мерасад, пурзӯркунӣ оғоз мешавад, ки метавонад тақвияти ғайримуқаррариро ба вуҷуд орад ва PCR-и гарм метавонад ин мушкилотро ҳал кунад.
Оғози гарми PCR чист?Пас аз омода кардани системаи реаксия, тағирдиҳандаи фермент дар ҳарорати баланд (одатан баландтар аз 90 ° C) дар марҳилаи гармкунии ибтидоии реаксия ё марҳилаи "оғози гарм" бароварда мешавад, то полимерази ДНК фаъол шавад.Вақти дақиқи фаъолсозӣ ва ҳарорат аз табиати полимерази ДНК ва тағирдиҳандаи гарми оғоз вобаста аст.Ин усул асосан тағирдиҳандаҳоро ба монанди антителоҳо, лигандҳои наздикӣ ё тағирдиҳандаҳои кимиёвӣ барои ҷилавгирӣ аз фаъолияти полимеразаи ДНК истифода мебарад.Азбаски фаъолияти полимеразаи ДНК дар ҳарорати хонагӣ монеъ мешавад, технологияи оғози гарм барои омода кардани системаҳои сершумори реаксияҳои ПТР дар ҳарорати хонагӣ бидуни қурбонии хосияти реаксияҳои ПТР роҳати бузург фароҳам меорад.
2. RT-PCR
RT-PCR (PCR транскрипсияи баръакс) як усули таҷрибавӣ барои транскриптсияи баръакс аз mRNA ба cDNA ва истифода аз он ҳамчун қолаб барои амплификация мебошад.Тартиби таҷрибавӣ ин аст, ки аввал истихроҷи умумии РНК дар бофтаҳо ё ҳуҷайраҳо, истифода Oligo (dT) ҳамчун праймер, истифода транскриптазаи баръакс барои синтези cDNA ва сипас истифода cDNA ҳамчун қолиб барои тақвияти PCR барои ба даст овардани гени ҳадаф ё ошкор кардани ифодаи ген.
3. Флуоресценти PCR миқдорӣ
Флуоресценти PCR (PCR миқдорӣ дар вақти воқеӣ,RT-qPCR) ба усули илова кардани гурӯҳҳои флюоресцентӣ ба системаи реаксияи ПТР, бо истифода аз ҷамъоварии сигналҳои флуоресцентӣ барои назорат кардани тамоми раванди ПТР дар вақти воқеӣ ва дар ниҳоят истифодаи каҷи стандартӣ барои таҳлили миқдорӣ қолабро дар назар дорад.Усулҳои маъмулан qPCR истифодашаванда SYBR Green I ва TaqMan мебошанд.
4. PCR лона
PCR лона ба истифодаи ду маҷмӯи праймерҳои ПТР барои ду даври пурқувваткунии ПТР дахл дорад ва маҳсули тақвияти даври дуюм порчаи гени мавриди ҳадаф аст.
Агар номувофиқатии ҷуфти якуми праймерҳо (праймерҳои беруна) боиси пурзӯр шудани ҳосили ғайримуқаррарӣ гардад, эҳтимолияти эътироф кардани ҳамон минтақаи ғайримуқаррарӣ аз ҷониби ҷуфти дуюми праймерҳо ва идома додани афзоиш хеле кам аст, бинобар ин амплификация бо ҷуфти дуюми праймерҳо, хосияти PCR беҳтар шудааст.Як бартарии иҷрои ду даври ПТР дар он аст, ки он барои тақвият додани маҳсулоти кофӣ аз ДНК-и маҳдуди ибтидоӣ кӯмак мекунад.
5. PCR-и тамос
Touchdown PCR як усули беҳтар кардани хусусияти реаксияи PCR тавассути танзими параметрҳои давраи PCR мебошад.
Дар PCR touchdown, ҳарорати гармкунӣ барои чанд давраҳои аввал аз ҳарорати максималии гармкунӣ (Tm)-и праймерҳо чанд дараҷа болотар муқаррар карда мешавад.Ҳарорати баландтари гармкунӣ метавонад амплификацияи ғайримуқаррариро ба таври муассир коҳиш диҳад, аммо дар айни замон, ҳарорати баландтари гармкунӣ ҷудошавии праймерҳо ва пайдарпаии мақсаднокро бадтар мекунад ва дар натиҷа ҳосили PCR кам мешавад.Аз ин рӯ, дар чанд давраҳои аввал, ҳарорати гармкунӣ одатан дар як давра то 1 ° C паст мешавад, то мундариҷаи гени мақсаднок дар система афзоиш ёбад.Вақте ки ҳарорати гармкунӣ то ҳарорати оптималӣ паст карда мешавад, ҳарорати гармкунӣ барои давраҳои боқимонда нигоҳ дошта мешавад.
6. PCR мустақим
ПТР мустақим ба тақвияти ДНК-и ҳадаф бевосита аз намуна бе зарурати ҷудокунӣ ва тозакунии кислотаи нуклеинӣ дахл дорад.
Ду намуди PCR мустақим вуҷуд дорад:
усули мустақим: миқдори ками намуна гиред ва онро мустақиман ба PCR Master Mix барои муайянкунии PCR илова кунед;
усули крекинг: пас аз гирифтани намуна, онро ба лизат илова кунед, лиза кунед, то геномро озод кунед, миқдори ками супернатанти лизиро гиред ва онро ба PCR Master Mix илова кунед, идентификатсияи ПТР-ро анҷом диҳед.Ин равиш ҷараёни кори таҷрибавиро содда мекунад, вақти амалиро кам мекунад ва аз талафоти ДНК дар марҳилаҳои тозакунӣ пешгирӣ мекунад.
7. SOE PCR
Пайвасткунии генҳо тавассути паҳншавии такрори PCR (SOE PCR) праймерҳоро бо нуқҳои иловагӣ истифода мебарад, то маҳсулоти ПТР занҷирҳои такрорӣ ба вуҷуд оранд, то ки дар реаксияи минбаъдаи амплификация тавассути васеъ кардани занҷирҳои такрорӣ, манбаъҳои гуногуни техникаи А, ки дар он порчаҳои пурқувватшуда ба ҳам мепайванданд. ва ба ҳам пайваст.Ин технология дар айни замон ду самти асосии татбиқ дорад: сохтани генҳои синтез;Мутацияи ген, ки ба макон нигаронида шудааст.
8. IPCR
ПТР-и баръакс (IPCR) барои тақвият додани порчаҳои ДНК ба ғайр аз ду праймер, праймерҳои иловагии баръаксро истифода мебарад ва пайдарпаии номаълумро дар ҳар ду тарафи порчаи маълуми ДНК тақвият медиҳад.
IPCR дар ибтидо барои муайян кардани пайдарпаии минтақаҳои номаълуми ҳамсоя тарҳрезӣ шуда буд ва бештар барои омӯзиши пайдарпайии промоторҳои генҳо истифода мешавад;азнавсозии хромосомаҳои онкогенӣ, аз қабили синтези генҳо, транслокатсия ва транспозиция;ва интегратсияи генҳои вирусӣ низ маъмулан ҳоло истифода мешаванд.
9. dPCR
PCR рақамӣ (dPCR) як усули муайян кардани миқдори мутлақи молекулаҳои кислотаи нуклеинӣ мебошад.
Дар айни замон се усули муайян кардани миқдори молекулаҳои кислотаи нуклеин вуҷуд дорад.Фотометрия ба ҷаббиши молекулаҳои кислотаи нуклеин асос ёфтааст;PCR-и миқдорӣ дар вақти воқеӣ флуорессент (ПЗР Real Time) ба арзиши Ct асос ёфтааст ва арзиши Ct ба рақами давраи мувофиқ ба арзиши флуорессенсия, ки мумкин аст ошкор мешавад, ишора мекунад;рақамӣ PCR технологияи навтарини миқдорӣ дар асоси усули якмолекулаи ПТР барои ҳисобкунии миқдори кислотаи нуклеинӣ як усули мутлақ миқдорӣ мебошад.
Вақти фиристодан: июн-13-2023